【背景】

CIK 是「Cytokine-Induced Killer Cells」的缩写，中文全称为「细胞因子诱导的杀伤细胞」。 CIK 是单个核细胞在 CD3 单抗和多种细胞因子 （包括 IFN-γ, IL-2 等） 的作用下培养获得的一群以 CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群， 其既具有 T 淋巴细胞强大的抗肿瘤活 性，又具有 NK 细胞 （自然杀伤细胞） 的非 MHC （主要组织相容性抗原） 限制性肿瘤杀伤能力。 CIK 细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前 临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。

DC 是「Dendritic  Cells」的缩写，中文全称为「树突状细胞」，因其成熟时伸出许多树 突样或伪足样突起而得名。DC 是由 2011 年诺贝尔奖获得者、加拿大籍科学家 Ralph M. Steinman 于 1973 年发现的，是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞 （Antigen Presenting Cells, APC）。已证实，DC 是唯一能够显著刺激初始 T 细胞 （Naïve  T cells） 增殖的 APC,而其它 APC （如单核巨噬细胞，B 细胞等） 仅能刺激已活化的或记忆性的 T 细胞。DC 是机体适应性 T 细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中具有极其重要的作用。

DC-CIK 即 DC 和 CIK 细胞在体外共培养，然后回输给患者。严格的说，最终的效应细 胞是经 DC 体外活化的 CIK 细胞。多项研究表明，DC 与 CIK 具有协同作用，共同孵育后， DC 表面共刺激分子的表达及抗原递呈能力均明显提高，而 CIK 的增殖能力和体内外细胞毒 活性也得以增强，因此 DC-CIK 较单独的 CIK 治疗更为有效。若将肿瘤抗原负载的 DC 与 CIK 共培养，可刺激产生肿瘤抗原特异性的 T 细胞，这样的 DC-CIK 治疗则兼具特异性和非 特异性双重肿瘤杀伤作用，比未负载肿瘤抗原的 DC 刺激活化的 CIK 活性更强，常被用于 临床和科研。

【培养原理】

1.DC 培养用细胞因子：

GM-CSF （粒细胞巨噬细胞集落刺激因子）：

GM-CSF 是一种造血生长因子，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞的集落形成， 并具有促进早期红巨核细胞、嗜酸性祖细胞增殖和发育的功能。GM-CSF 是最早被鉴定 出来对于 DC 有作用的细胞因子之一。

GM-CSF 在 DC 培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，细胞表面 MHC II 类分子的表达得以提高，从而增强细胞的抗原递呈功能。此外，GM-CSF 还可促进 DC 的存活。

IL-4 （白细胞介素-4）

IL-4 在由单核细胞诱导成 DC 的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从 而引导单核细胞向 DC 方向分化。若培养体系中不加 IL-4,单核细胞将分化为巨噬细胞。

同时，IL-4 还有降低细胞表面表达 CD14 分子的能力。CD14 表达水平的降低是单核细 胞分化为 DC 的重要标志。

GM-CSF 和 IL-4 共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟 DC  （immature  DC），此时的 DC 具有较强的抗原摄取和加工能力，但抗原递呈能力很弱。细胞表面中度表达 MHC I 类、II 类分子和 B7 家族分子 （CD80, CD86 等），但不表达 CD14.

TNF-α （肿瘤坏死因子-α）

TNF-α可下调未成熟 DC 的巨胞饮作用和表面 Fc 受体的表达，使细胞内 MHC II 类 分子区室 （class II compartment） 消失，但能够上调细胞表面 MHC I 类、II 类分子和 B7 家 族分子 （CD80, CD86 等） 的表达，使未成熟 DC 分化为成熟 DC（mature DC），此时 DC 的 抗原摄取和加工能力明显减弱，而抗原递呈能力显著增强，可极强的激活 T 细胞。

2.CIK 培养用细胞因子和抗体：

CD3 激发型单抗：

T 细胞活化的第一信号来自于 T 细胞表面的受体，即 T 细胞抗原受体 （T cell antigen receptor,  TCR） 与 APC 提呈的抗原的特异性结合，也就是 T 细胞对抗原的特异性识别。 TCR 是由 2 条不同肽链构成的异二聚体，在 T 细胞表面，其与 CD3 分子通过非共价键 结合，形成 TCR/CD3 复合体。TCR 识别特异性抗原后会引起 CD3 和 T 细胞表面的辅助 受体 CD4 或 CD8 分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶 （Lck, Fyn 和 ZAP-70 等），促使 CD3 分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序 （immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM） 中的酪氨酸 （Y） 磷酸化。磷酸化的酪氨酸 （pY） 进一步 磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应 （磷脂酰肌醇途径或 MAP 激 酶途径等），最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控 T 细胞增殖和活化的靶基因 （如 IL-2 和 IFN-γ 等），引起基因的表达和转录，T 细胞因而由静止状态转为 增殖和活化状态。

由上可见，CD3 分子在 T 细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3 激发 型单抗与 T 细胞表面 CD3 分子特异性结合后，可引起 CD3 分子胞浆区 ITAM 基序中酪 氨酸的磷酸化，进而导致 T 细胞增殖和活化的下游信号的激活，从而使 T 细胞增殖和活 化。也就是说，CD3 激发型单抗能够模拟抗原与 TCR/CD3 复合物的识别和激活过程， 从而引起 T 细胞的增殖与活化，因此是 CIK 细胞培养中不可或缺的刺激因素。

此外，CD3 激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为 OKT-3 的 CD3 激发型单抗可以刺激所有人的 T 细胞的增殖，而其它克隆号的 CD3 激发型单抗 仅能刺激一部分人的 T 细胞。因此，在进行 CIK 培养时，最好选用 OKT-3 克隆，以保 证每个患者的 T 细胞均能被激活。

IL-2 （白细胞介素-2）

IL-2 最初发现时被称为 T 细胞生长因子 （T cell growth factor, TCGF），是引起 T 细胞 增殖最重要的细胞因子。IL-2 既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与 T 细胞表面的 IL-2 受体 （IL-2R） 的特异性结合而促使 T 细胞活化，并进入细胞分裂状态。

此外，IL-2 还可刺激 NK 细胞的生长并增强其杀伤能力。因此 CIK 细胞培养中须添加IL-2,以促进 T 细胞的增殖与活化。

IFN-γ （干扰素-γ）

IFN-γ 具有上调外周血淋巴细胞表面 IL-2R 表达的作用，因此会增强 T 细胞对 IL-2 促 增殖反应的敏感度和强度。在诱导 CIK 细胞形成的过程中加入 IFN- g ,可降低 IL-2 的用量。 研究发现，IFN-γ加入的顺序与 CIK 的细胞毒活性密切相关。先加入 IFN- g,培养24后再 加入 IL-2,可明显提高 CIK 的细胞毒活性。

IL-1α（白细胞介素-1α）

IL-1α也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达 IL-2R.当 IL-1α与 IFN-γ和激发型CD3 单抗合用时，可以明显提高 CIK 的细胞毒作用。

【细胞制备】

1. 外周血单个核细胞的采集

1.1用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞 80 - 100 ml。

1.2淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞 （PBMC）。

1.3无血清培养液洗涤 2 次，获得纯度在 90% 以上的 PBMC,细胞数量需达到 1-3 x10⁸。

2. （可选步骤）  肿瘤抗原的制备

用于负载 DC 的肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原肽 （Tumor-Specific  Antigens,  TSA）或肿瘤相关抗原 （Tumor-αssociated Antigens, TAA），也可以是肿瘤全细胞抗原。

用 TSA 或 TAA 负载的 DC 具有很好的靶向性，但该方法具有已确定的肿瘤特异性 抗原或抗原肽种类少和单一抗原的免疫攻击经常无法杀伤肿瘤细胞等缺陷。而用肿瘤全 细胞抗原负载 DC 可克服这些缺陷，因为此时无需知道那些抗原是肿瘤细胞的 TSA 或 TAA,而且全抗原中的多种不同肿瘤抗原冲击 DC 可诱导产生针对不同抗原决定簇的细 胞毒 T 淋巴细胞 （CTL） 克隆，从而实现对肿瘤细胞的有效杀伤。

肿瘤细胞全抗原负载 DC 的方法很多，包括用肿瘤细胞裂解液负载 DC、用凋亡肿 瘤细胞负载 DC、用坏死或死亡的肿瘤细胞负载 DC,用肿瘤活细胞负载 DC,和将肿瘤 细胞与 DC 融合等。目前临床上常用的是用肿瘤细胞裂解液负载 DC,因该方法简单、 快速、有效。

反复冻融是获得肿瘤细胞裂解液的常见方法，具体步骤如下：

2.1手术切除肿瘤标本，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净；

2.2无菌生理盐水洗 3 次；

2.3用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入 RPMI 1640 培养基，充分研磨；

2.4200 目无菌网过滤后收集单细胞悬液；

2.5用 RPMI 1640 培养基重悬细胞至 1-2 x 107/ml,装入 5 ml 无菌冻存管中；

2.6将冻存管浸入液氮中速冻，10 min 后取出，再迅速放入 37oC 水浴中解冻 10 min。反复 3-5 次；注：也可以-80oC/37oC 反复冻融 3-5 次。

2.7 将肿瘤裂解物加入离心管中，3000rpm,离心 10 min；

2.8收取上清，0.22mm 滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体；2.9-80oC 保存备用。

3. CIK 细胞的培养及鉴定

3.1 步骤 1 中获得的 PBMC 用无血清培养液调整细胞浓度至 2 x 10⁶/ml,置于培养瓶内；

3.2 37℃，5%CO2 培养箱中孵育 2 h,以使单核细胞贴壁。

3.3 收集悬浮细胞，用无血清培养液调整细胞浓度至 1-2 x 10⁶/ml。

3.4 加入 1,000 U/ml  的重组人 IFN-γ 培养；

3.5 24 h  后加入 50ng/ml  的 CD3  单克隆抗体和 300 U/ml  的重组人 IL-2,刺激 CIK  细 胞的生长和增殖；注：此时也可同时加入 100 U/ml 的重组人 IL-1α.

3.6 每 3 天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人 IL-2 300 U/ml；

3.7在培养的第 7d,收获 CIK 细胞，此时数量应达到 1x 109 个以上。

3.8 CIK 细胞质控：

3.8.1 台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在 80% 以上；3.8.2 用流式细胞仪检测细胞表面  CD3、CD8  和 CD56  等分子的表达 ,观察CD3+CD56+细胞的比例是否明显提高。

4. DC 细胞的培养及鉴定

4.1 步骤 3.2 中剩下的贴壁细胞 （主要是 CD14+的单核细胞），加入含重组人 GM-CSF500-1,000U/ml 和重组人 IL-4 500U/ml 的无血清培养液，37℃，5%CO2 培养箱中 培养，诱导单核细胞向 DC 细胞分化。

4.2 每 3d 半量换液一次，并补足细胞因子；

4.3（可选步骤） 在培养的第 5d, 加入步骤 2 中获得的肿瘤抗原 50 mg/ml,对 DC 进 行抗原负载；注：若不对 DC 进行抗原负载，该步省略。

4.4 在培养的第 6d,加入重组人 TNF-α（500U/ml），诱导 DC 细胞成熟。

4.5在培养的第 7d 或第 8d,收获 DC  细胞，其数量应达到 1×10⁶  个以上。

4.6DC 的质检：

4.6.1 台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在 80% 以上；

4.6.2 流式细胞仪检测 DC 细胞表面 HLA-DR、CD83 和 CD86 等分子的表达，以 确定 DC 是否成熟。

5. DC-CIK 细胞的制备和质检

5.1 收集步骤 4 和步骤 3 中所获得的 DC 细胞和 CIK 细胞，按 1∶10 （数目比） 的比例共培养，无血清培养液中添加重组人 IL-2 （300 U/ml）。

5.2每 3 天半量换液一次，并补加重组人 IL-2 （300U/ml）。

5.3 在第 7d  收集细胞，细胞数量应达到 1×10¹⁰ 个以上。

5.4 DC-CIK 细胞的质检：

5.4.1 台盼蓝染色检测：活细胞应在 80% 以上；

5.4.2 流式细胞仪检测细胞表面 CD3、CD8、CD56 等分子的表达：CD3+CD56+细 胞的比例应在 20% 以上。

5.4.3 细胞杀伤实验：以 DC-CIK 细胞为效应细胞，以肿瘤细胞 （可为原代肿瘤细 胞或肿瘤细胞株） 为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按 10 : 1（数目比）  的比例加 入 96 孔 U 型板中，每孔含靶细胞 1 x 10⁴ 个，终体积为 200 ml，设 3 个复 孔。培养 4 h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶 （LDH） 试剂盒检测效应细胞 对靶细胞的杀伤率。

5.4.4 收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体， 及内毒素 （标准：病原学检测阴性，内毒素<5 Eu）。

【步骤简图】

【推荐试剂】

生产商	产品名称	产品编号	产品规格	使用浓度
PeproTech	重组人 GM-CSF (Animal Free)	AF-300-03	20ug/50ug/100ug/250ug/500ug1mg	50-100ng/ml
PeproTech	重组人 IFN-g (Animal Free)	AF-300-02	100ug/250ug/500ug/1mg	50ng/ml
PeproTech	重组人 IL1-a (Animal Free)	AF-200-01A	10ug/100ug/250ug/500ug/1mg	0.1ng/ml
PeproTech	重组人 IL-2 (Animal Free)	AF-200-02	50ug/100ug/250ug/500ug/1mg	30ng/ml
PeproTech	重组人 IL-4 (Animal Free)	AF-200-04	20ug/50ug/100ug/250ug/500ug/1mg	100ng/ml
PeproTech	重组人 TNF-a (Animal Free)	AF-300-01A	10ug/50ug/100ug/250ug/500ug/1mg	25ng/ml
PeproTech	人 CD3 激发型单抗	05121-25	100ug/500ug	50ng/ml
(BioGems)	(克隆：OKT-3)

注：Animal Free 意为无动物成分。无动物成分的重组细胞因子在生产过程中不会有任何动物源性物质，尤其是牛蛋白的混入，使得最终获得的重组人蛋白中不含任何动物成分。这样可避免动物病原体 （如疯牛病，克雅氏病等） 的污染 及外源蛋白引起的机体异种排斥和过敏反应，因此细胞治疗的体外细胞培养过程中最好使用无动物成分的重组细胞 因子。

【其它相关试剂】
 

生产商	产品名称	产品编号	产品规格
PeproTech	重组人 Flt-3 Ligand (Animal Free)	AF-300-19	10ug/50ug/100ug/250ug/500ug/1mg
PeproTech	重组人 IL-7 (Animal Free)	AF-200-07	10ug/100ug/250ug/500ug/1mg
PeproTech	重组人 IL-15 (Animal Free)	AF-200-15	10ug/100ug/250ug/500ug/1mg
PeproTech	重组人 SCF (Animal Free)	AF-300-07	10ug/50ug/100ug/250ug/500ug/1mg
PeproTech	人 CD28 激发型单抗	10311-25	100ug/500ug
(BioGems)	(克隆：CD28.2)

【参考文献】

[1] Steinman RM, Cohn ZA. “Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution”. J. Exp. Med. 1973; 137 （5）：1142–62.

[2]  张志伟，宋鑫。DC-CIK 细胞临床制备规范化研究。中国肿瘤，2011;20（2）：85-88.

[3] Li R, Wang C, et al. Autologous cytokine-induced killer cell immunotherapy in lung cancer:a phase II clinical study. Cancer Immunol Immunother. 2012; 61:2125–2133