【背景】
       CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。 CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-g,IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3⁺CD56⁺细胞为主要效应细胞的异质细胞群， 其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。
 
       DC是“Dendritic Cells”的缩写，中文全称为“树突状细胞”，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC是由2011年诺贝尔奖获得者、加拿大籍科学家Ralph M. Steinman于1973年发现的，是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cells, APC)。已证实，DC是唯一能够显著刺激初始T细胞(Naïve T cells)增殖的APC，而其它APC(如单核巨噬细胞，B细胞等)仅能刺激已活化的或记忆性的T细胞。DC是机体适应性T细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中具有极其重要的作用。
 
        DC-CIK即DC和CIK细胞在体外共培养，然后回输给患者。严格的说，最终的效应细胞是经DC体外活化的CIK细胞。多项研究表明，DC与CIK具有协同作用，共同孵育后，DC表面共刺激分子的表达及抗原递呈能力均明显提高，而CIK的增殖能力和体内外细胞毒活性也得以增强，因此DC-CIK较单独的CIK治疗更为有效。若将肿瘤抗原负载的DC与CIK共培养，可刺激产生肿瘤抗原特异性的T细胞，这样的DC-CIK治疗则兼具特异性和非特异性双重肿瘤杀伤作用，比未负载肿瘤抗原的DC刺激活化的CIK活性更强，常被用于临床和科研。
 
【培养原理】
1．DC培养用细胞因子：

•   GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)：

               GM-CSF是一种造血生长因子，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞的集落形成，并具有促进早期红巨核细
        胞、嗜酸性祖细胞增殖和发育的 功能。GM-CSF是最早被鉴定出来对于DC有作用的细胞因子之一。
 
               GM-CSF在DC培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，细胞表面MHC II类分子的表达得以提高，
        从而增强细胞的抗原递呈功能。 此外，GM-CSF还可促进DC的存活。

•    IL-4 (白细胞介素-4)

                IL-4在由单核细胞诱导成DC的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从而引导单核细胞向DC方向
        分化。若培养体系中不加IL-4，单核细胞将分化为巨噬细胞。同时，IL-4还有降低细胞表面表达CD14分子的能
        力。CD14表达水平的降低是单核细胞分化为DC的重要标志。
 
               GM-CSF和IL-4共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟DC(immature DC)，此时的DC具有较强的抗原摄取 
        和加工能力，但抗原递呈能力很弱。细胞表面中度表达MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)，  但不
        表达CD14。

•    TNF-a(肿瘤坏死因子-a)

                TNF-a可下调未成熟DC的巨胞饮作用和表面Fc受体的表达，使细胞内MHC II类分子区室(class II     
         compartment)消失，但能够上调细胞表面 MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)的表达，使未成熟
         DC分化为成熟DC(mature DC)，此时DC的抗原摄取和加工能力明显减弱，而抗原递呈能力显著增强，可极强的
         激活T细胞。
 
2．CIK培养用细胞因子和抗体： 

•    CD3激发型单抗：

                T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)与APC提呈
         的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表
         面，其与CD3分子通过非共价键结合，形成TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的  
         辅助受体CD4或CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶 (Lck, Fyn和ZAP-70等)，促使
         CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸
         (Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇
         途径或MAP激酶途径等)，最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(
         如IL-2和IFN-g等)，引起基因的表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。
 
                由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子
         特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激
         活，从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能 够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，
        从而引起T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。 
         
                此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗可以刺
          激所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此，在进行CIK培养
          时，最好选用OKT-3克隆，以保证每个患者的T细胞均能被激活。

•    IL-2 (白细胞介素-2)

                IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-
          2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞
          活化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加
          IL-2，以促进T细胞的增殖与活化。

•    IFN-g(干扰素-g)

                 IFN-g;具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强
          度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN-g ，可降低IL-2的用量。研究发现，IFN-g加入的顺序与CIK的细胞毒活
          性密切相关。先加入IFN-g，培养24后再加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。

•    IL-1-a (白细胞介素-1a) 　

                IL-1a也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1a与IFN-g和激发型CD3单抗合用时，可以明显
          提高CIK 的细胞毒作用。
 
【细胞制备】
1． 外周血单个核细胞的采集
       1.1      用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞80 - 100ml；
       1.2      淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)。
       1.3      无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC，细胞数量需达到1-3 x 10⁸。
  
2． (可选步骤) 肿瘤抗原的制备 
                用于负载DC的肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或肿瘤相关抗原(Tumor-
        Associated Antigens, TAA)，也可以是肿瘤全细胞抗原。
 
                用TSA或TAA负载的DC具有很好 可克服这些缺陷，因为此时无需知道那些抗原是肿瘤细胞的TSA或TAA，
        而且全抗原中的多种不同肿瘤抗原冲击DC可诱导产生针对不同抗原决定簇的细胞毒T 淋巴细胞(CTL)克隆， 从而
        实现对肿瘤细胞的有效杀伤。
   
                肿瘤细胞全抗原负载DC的方法很多，包括用肿瘤细胞裂解液负载DC、用凋亡肿瘤细胞负载DC、用坏死或
        死亡的肿瘤细胞负载DC，用肿瘤 活细胞负载DC，和将肿瘤细胞与DC融合等。目前临床上常用的是用肿瘤细胞
        裂解液负载DC，因该方法简单、快速、有效。
 
                反复冻融是获得肿瘤细胞裂解液的常见方法，具体步骤如下：
         2.1      手术切除肿瘤标本，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净；
         2.2      无菌生理盐水洗3次；
         2.3      用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入RPMI 1640培养基，充分研磨；
         2.4      200目无菌网过滤后收集单细胞悬液；
         2.5      用RPMI 1640培养基重悬细胞至1-2 x 10⁷/ml，装入5ml无菌冻存管中；
         2.6      将冻存管浸入液氮中速冻，10 min后取出，再迅速放入37^oC水浴中解冻10 min。反复3-5次；
                   注：也可以-80^oC/37^oC反复冻融3-5次。
         2.7      将肿瘤裂解物加入离心管中，3000rpm，离心10min；
         2.8      收取上清，0.22mm滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体；
         2.9      -80^oC保存备用。

3． CIK细胞的培养及鉴定
         3.1      步骤1中获得的PBMC 用无血清培养液调整细胞浓度至2 x 10⁶/ml，置于培养瓶内；
         3.2      37℃，5%CO₂培养箱中孵育2h，以使单核细胞贴壁;
         3.3      收集悬浮细胞，用无血清培养液调整细胞浓度至1-2 x 10⁶/ml；
         3.4      加入1,000 U/ml 的重组人IFN-g培养；
         3.5      24h 后加入50ng/ml 的CD3 单克隆抗体和300 U/ml 的重组人IL-2，刺激CIK 细胞的生长和增殖；
                     注：此时也可同时加入100 U/ml的重组人IL-1a。
         3.6      每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；
         3.7      在培养的第7d，收获CIK细胞，此时数量应达到1x 10⁹个以上。
         3.8      CIK细胞质控：
                  3.8.1  台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；
                  3.8.2  用流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8和CD56 等分子的表达，观察CD3⁺CD56⁺细胞的比例是否明
                             显提高。
 
4． DC 细胞的培养及鉴定
          4.1      步骤3.2中剩下的贴壁细胞(主要是CD14⁺的单核细胞)，加入含重组人GM-CSF 500-1,000U/ml和重组人
                     IL-4 500U/ml的无血清培养液，37℃，5%CO₂培养箱中培养，诱导单核细胞向DC细胞分化；
          4.2      每3d 半量换液一次，并补足细胞因子；
          4.3      (可选步骤) 在培养的第5d， 加入步骤2中获得的肿瘤抗原50 mg/ml，对DC进行抗原负载；
                      注：若不对DC进行抗原负载，该步省略。
          4.4      在培养的第6d，加入重组人TNF-α(500U/ml)，诱导DC 细胞成熟；
          4.5      在培养的第7d或第8d，收获DC 细胞，其数量应达到1×10⁶个以上；
          4.6      DC的质检：
                  4.6.1  台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；
                  4.6.2  流式细胞仪检测DC 细胞表面HLA-DR、CD83 和CD86 等分子的表达，以确定DC是否成熟。
 
5.     DC-CIK细胞的制备和质检
          5.1      收集步骤4和步骤3中所获得的DC 细胞和CIK 细胞，按1∶10 (数目比)的比例共培养，无血清培养液中添
                     加重组人IL-2 (300 U/ml)；
          5.2      每3天半量换液一次，并补加重组人IL-2 (300U/ml)。
          5.3      在第7d 收集细胞，细胞数量应达到1×10¹⁰个以上；
          5.4      DC-CIK细胞的质检：
                   5.4.1      台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；
                   5.4.2      流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3⁺CD56⁺细胞的比例应在20%
                                  以上。
                   5.4.3      细胞杀伤实验：以DC-CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶
                                  细胞，将效应细胞与靶细胞按10 :1(数目比) 的比例加入96 孔U 型板中，每孔含靶细胞 1 x 10⁴
                                  个，终体积 为200 ml，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检
                                  测效应细胞对靶细胞的杀伤率。
                   5.4.4      收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病
                                  原学检测阴性，内毒素<5 Eu)。

 【步骤简图】
                     
 
 
       【推荐试剂】

生产商	产品名称	产品编号	产品规格	使用浓度
PeproTech	重组人GM-CSF (Animal Free)	AF-300-03	20ug/50ug/100ug/250ug/500ug/1mg	50-100ng/ml
PeproTech	重组人IFN-g(Animal Free)	AF-300-02	100ug/250ug/500ug/1mg	50ng/ml
PeproTech	重组人IL1-a(Animal Free)	AF-200-01A	10ug/100ug/250ug/500ug/1mg	0.1ng/ml
PeproTech	重组人IL-2 (Animal Free)	AF-200-02	50ug/100ug/250ug/500ug/1mg	30ng/ml
PeproTech	重组人IL-4 (Animal Free)	AF-200-04	20ug/50ug/100ug/250ug/500ug/1mg	100ng/ml

      的 污染及外源蛋白引起的机体异种排斥和过敏反应，因此细胞治疗的体外细胞培养过程中最好使用无动物成分的
      重组细胞因子。

       【其它相关试剂】

生产商	产品名称	产品编号	产品规格
PeproTech	重组人Flt-3 Ligand(Animal Free)	AF-300-19	10ug/50ug/100ug/250ug/500ug/1mg
PeproTech	重组人IL-7 (Animal Free)	AF-200-07	10ug/100ug/250ug/500ug/1mg
PeproTech	重组人IL-15 (Animal Free)	AF-200-15	10ug/100ug/250ug/500ug/1mg
PeproTech	重组人SCF (Animal Free)	AF-300-07	10ug/50ug/100ug/250ug/500ug/1mg

 
          【参考文献】
            [1] Steinman RM, Cohn ZA. "Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I.  
                  Morphology, quantitation, tissue distribution".J. Exp. Med. 1973; 137 (5): 1142–62.
            [2] 张志伟，宋鑫。DC-CIK 细胞临床制备规范化研究。中国肿瘤，2011；20(2)：85-88.
            [3] Li R, Wang C, et al. Autologous cytokine-induced killer cell immunotherapy in lung cancer: a phase II
                 clinical study. Cancer Immunol Immunother. 2012; 61:2125–2133.