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成人小肠类器官的培养与分化

发布时间:2020-08-27 16:20 |  点击次数:


2011年,Hans Clevers等首先报道了成人小肠类器官的构建方法,人小肠类器官分别具有小肠上皮组织隐窝和绒毛区域细胞的特征,小肠类器官与小肠上皮组织在细胞组成和形态结构上高度相似,并具有良好的短狀吸收和离子转运功能。人小肠类器官的培养条件与小鼠小肠类器官不同,除了加入基本生长因子外(EGF, Noggin,R-Spondin-1, Wnt-3a),还需要添加一些激素和维生素类物质,如胃泌素(gastrin)和烟酰胺(Nicotinamide),可以延长类器官的存活时间,另外加入A83- 01和SB202190,可以抑制类器官的死亡,提高类器官形成率。在这样的培养条件下,人小肠类器官呈现出芽状结构,增殖的干细胞处于出芽部位,小肠类器官经过传代培养,可以存活6个月以上,并且可以保持基因型不变。以上培养条件可用于人类肠道类器官的长期培养与扩增,但却不能像小鼠类器官那样可以分化为各种肠上皮细胞,在上述培养条件的基础上去除Wnt3A、Nicotinamide和SB202190,同时加入DAPT小分子,则可以诱导肠干细胞分化为各种终末分化结肠上皮细胞。人小肠类器官模型的建立,有望推动小肠生理与疾病基础研究的发展并且在药物开发、个体化治疗、基因治疗以及再生医学等方面具有巨大的应用前景。
 

◆成人小肠类器官的制备◆

 
1. 肠道手术或肠镜活检取得的正常肠组织标本保存于4 ℃的Dulbecco′s磷酸盐缓冲液(DPBS)中运输,用4 ℃含青霉素和链霉素的DPBS反复冲洗标本至洗涤液澄清。

2. 用镊子轻刮标本黏膜面去除黏液,将小肠组织标本转移至盛10cm细胞培养皿上,加入一定量的DPBS。

3. 使用灭菌弯尖眼科剪,将组织标本剪碎,直至组织块直径小于1mm,使用预冷1%BSA溶液润洗移液管管壁后,将组织块转移至15ml离心管中。待组织块沉淀后,吸除上清液,加入10ml预冷DPBS, 重悬8-10次。按上述方法漂洗 3-5次,直至上清变澄清。

4. 去除上述澄清液。加入3ml解离缓冲液,使用预冷1%BSA溶液润洗移液管管壁后,将重悬液转移至 6孔细胞培养板中,并加入300ulEDTA(50mM)。冰上震荡消化30min左右,直至大部分隐窝游离。在显微镜下观察,游离的隐窝呈"腊肠样",隐窝原所在位置呈"甜甜圈样。

小肠隐窝消化液:2-5mM的EDTA, 此步骤后可以让组织碎片自然沉降后去除上清,继续消化一次

5. 收集消化后的溶液,让组织碎片通过重力沉降约1min。小心吸出并丢弃消化液,留下足够的液体以没过组织碎片。

6. 将组织碎片重悬于预冷的解离缓冲液,并用移液管上下吹打三次。静置直到大部分肠组织碎片沉降到底部。

7. 小心吸取上清液并使用70μm滤网过滤,将滤液收集于干净的50mL管中。

8. 重复上述6-7步骤几次,直至上清中没有隐窝,将几次获得上清收集在一起。

9. 在2-8℃下将上述收集的上清以200×g离心3分钟。小心地倒出并丢弃上清液。

10. 将沉淀重悬于含有10mL解离缓冲液中。200×g离心3分钟。轻轻倒出上清液。将肠隐窝沉淀留在管中。根据沉淀量加入适当体积的基础培养基重悬沉淀,如果单细胞过多,可再次离心,收集上清以去除单细胞。

11. 计数,吸取10μL置于玻璃载玻片或血细胞计数器上。使用倒置显微镜,计数10μL样本中的隐窝数量,200g离心5min,小心吸出并弃去上清。

12.用类器官培养基将隐窝的密度重悬至8-20个/ul,取出150ul隐窝悬液,加入等体积的未稀释的基质胶混合隐窝,小心地上下吹打十次以充分混匀,注意避免产生气泡。

13. 吸取50μL悬液,加入到提前预热的24孔板每个孔中的中心部位,样品应在每个孔的中心形成圆顶结构。为了防止接种时出现气泡,枪头内液体不要全部打出。

14. 将培养板在37°C下静置10分钟以待基质胶完全凝固。将平板转放入培养箱时,应注意不要破坏凝固后的液滴。

15. 使用移液枪沿着孔侧壁向每个孔中轻轻地加入500μL室温(15-25℃)的配制的类器官扩增培养基。不要将培养基从圆顶结构上直接加入。

16. 向其它未接种的孔中加入无菌PBS以保证培养时的湿度。 将培养板的盖子盖好,并在37℃和5%CO2下进行培养。

17. 隔天进行完全换液。换液时将移液枪头放在孔底边缘小心地将原有液体培养基吸出,并加入为500μL新鲜的室温类器官培养基。

18. 对于原代培养物,7-14天进行传代,对于已经传代的类器官,每7-10天传代一次,以1:3~1:5的比例进行类器官传代,以避免在类器官过度生长和空腔内积累过量的碎屑。

操作要点

❶ 镊子轻刮标本黏膜面去除黏液,否则后续得到的分馏会有很多杂细胞污染。
❷ 使用移液管(枪头)前用1%BSA溶液提取润洗,这样可以减少隐窝吸附在移液管(枪头)上,1%BSA可用DMEM培养基配制。
❸ 小肠隐窝消化液用5mM的EDTA,注意EDTA是否有析出,如析出太多会影响终浓度,有必要更换新的EDTA。
❹ 因分离小肠隐窝需要时间较久,建议整个操作在低温进行,离心机调至4℃,所用试剂溶液放冰上预冷。
❺ EDTA消化后,小肠组织会变松散,在外界机械力作用下,小肠隐窝会从组织中分离出来,可以重复几次通过外界机械力作用得到不同的分馏组分混合,也可以挑选隐窝含量较高,杂细胞较少的分馏组分种板培养。
❻ 得到分馏组分后进行隐窝计数,用完全培养基重悬隐窝至8~20个/μl,加入等体积基质胶混合,该过程一定要在冰上操作,混合过程切勿产生气泡,否则影响后续观察以及隐窝培养状态,混匀过程可以调小量程,吸取的液体不要全部吹出。
❼ 购买的基质胶在冰上融化后分装冻存,操作过程中基质胶一定要放在冰上,未用完的液体状基质胶可以冻存,若凝固后请弃去。
 

◆成人小肠类器官的传代培养◆

 
1. 在成熟类器官的24孔板中,每孔加入约1ml预冷的细胞回收液,用1ml枪头吹打板底的基质胶,直到基质胶全部打碎,收集每个孔中的悬液置于15 ml离心管中;
2. 将全部打碎的基质胶悬液冰上震荡消化10min;可用1ml大枪头继续吹打悬液,此过程避免产生气泡(调制量程到700ul可避免气泡产生),可取适量的悬液观察,直至看不到大块的类器官团块为止。
3. 加入10ml预冷的1%BSA溶液进行洗涤,离心弃去上清后用基质胶重悬。基质胶铺板后加入含有Y-27632的小肠类器官扩增培养基。

4. 传代中,若隐窝状态良好可进行1:3传代,若状态较差可进行1:1传代。全程可以维持约6个月的长期传代扩增,且类器官状态保持良好。

◆成人小肠类器官的冻存与复苏


准备冻存液:10%二甲基亚砜(DMSO)+20%胎牛血清(FBS)+70%DMEM/F12。

1. 将需要冻存的类器官冰上放置5~10 min。

2. 收集类器官,步骤同之前传代收集步骤一致。
3. 离心后弃上清,用800ul的冻存培养液重悬,将悬液移至冻存管中,放入冻存盒中于-80℃冰箱中保存24 h,如需长久保存,则24 h后转移至液氮罐保存。
复苏准备:37℃水浴箱

从液氮中取出冻存管后,立即放入37℃水浴中,使之迅速融解。等到冻存管中仅存一小片冰室,迅速将细胞转移到含9ml冷的基础培养基中(先将之置于15ml离心管中,放于冰上)。200g 室温离心5min,弃去上清,加入适量类器官培基重悬后与基质胶混合种板,加入含有Y-27632的小肠类器官扩增培养基。

◆配制小肠类器官扩增培养基


*扩增培养基可以用于人类肠道类器官的长期培养与扩增,但却不能像小鼠类器官那样可以分化为各种肠上皮细胞!

基础培养基:将青-链霉素( 1%) 、10mM HEPES、L-谷氨酰胺( 1%)加入至DMEM/F-12 培养基,第一次种板需要加入Y-27632,后续换液不需要加入Y-27632。
 

◆配制小肠类器官分化培养基


分化培养基在扩增培养基的基础上去除了WNT-3a,SB2020190,Nicotinamide,加入了DAPT。