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【论文分享】人肺类器官—COVID-19药物筛选的新工具

发布时间:2020-06-01 14:06 |  点击次数:

2020年5月5日,由美国康奈尔医院的Yuling Han团队在生物学预印本bioRxiv中发表的题为《Identification of Candidate COVID-19 Therapeutics using hPSC-derived Lung Organoids》的文章,全球首次报道了用肺类器官模型研究COVID-19及其治疗药物的筛选。
Yuling Han团队建立了人肺类器官SARS-CoV-2感染模型,并成功验证了三种被FDA批准治疗COVID-19感染的药物在该肺类器官模型中有效。
在此之前,都是通过SARS-CoV-2感染细胞系来筛选药物,但是细胞系很难模拟病毒感染后体内病理生理过程中的组织细胞行为,而SARS-CoV-2感染的人类器官可以部分模拟真实器官信号,因此使用该方法筛选的药物更具临床意义。今天就和大家分享一下这篇文章的实验操作。

 
Part 1 诱导hPSC分化为肺类器官,肺类器官组织对SARS-CoV-2伪病毒感染敏感,且体内外研究结果一致
   
研究人员们使用多种细胞因子及小分子组合体外定向诱导hPSC分化,使之分化为定型内胚层(DE),再分化为前肠内胚层(AFE)(前肠内胚层含肺部祖细胞(LPs) ),最终诱导其分化为肺类器官。通过分析单细胞转录组特征,鉴定肺类器官细胞类型,如II型肺泡细胞(AT2细胞, SP-B+SP-D+ABCA3+)、I型肺泡细胞(AT1细胞, PDPN+APQ5+)、基质细胞、增殖细胞、神经内分泌细胞(ASCL1+CALCA+)以及气道上皮细胞等(图1a)。

图1a 体外诱导肺类器官细胞类型鉴定


ACE2被公认为SARS-CoV-2的受体,TMPRSS2则是SARS-CoV-2感染细胞的关键跨膜蛋白酶,ACE2和TMPRSS2在SARS-CoV-2感染细胞的过程中发挥重要作用。Yuling Han团队证实肺类器官的AT2细胞表达上述两种分子(图1d),该研究结果与人肺scRNA-seq数据相一致。

图1d  ACE2和TMPRSS2在AT2细胞的表达(SFTPB、SFPTD和 ABCA3为AT2细胞的表面标志物)


研究人员使用表达SARS-CoV-2刺突糖蛋白的水疱性口炎病毒(VSV) - SARS-CoV-2伪病毒感染肺类器官。荧光素酶(LUC)活性检测结果显示SARS-CoV-2伪病毒能轻松入侵人hPSC诱导的肺类器官(图1f)。

图1f  ARS-CoV-2伪病毒感染肺类器官荧光素酶(LUC)活性检测结果


为了研究人类肺器官的体内模型,研究人员将体外培养了25天的肺祖细胞(LPs)注射到免疫缺陷的NSG小鼠皮下,待其生长分化4个月后(图1g),成为具有肺泡组织样结构(图1h)的异种移植体。免疫荧光染色结果显示,在异种移植体中存在大量表达ACE2的SP-B+AT2细胞(图1i)。

图1g-i  小鼠体内LPs诱导形成肺泡组织及组织内AT2细胞鉴定


研究人员将SARS-CoV-2伪病毒注射入移植体,24小时后检测到SP-B+AT2细胞荧光素酶(LUC)的表达显著高于对照组(图1j)。LPs诱导形成的肺异种移植体对SARS-CoV-2病毒感染同样敏感。
 
 
图1j SARS-CoV-2伪病毒感染肺异种移植体
 

Part 2 
考察SARS-CoV-2感染肺类器官可以模拟COVID-19的病理特点

 
研究人员将肺类器官与SARS-CoV-2共培养,考察SARS-CoV-2感染肺类器后病理变化,感染24小时后,肺类器官中SARS-CoV-2 DNA及SARS-S蛋白含量显著升高(图2a,b),RNA序列检测结果证实了SARS-CoV-2的强劲复制。研究人员还发现肺类器官中趋化因子及细胞因子表达显著上调,但并未检测到I型和III型IFNs。

图2 a,b  肺类器官中SARS-CoV-2 DNA及SARS-S蛋白含量检测结果

 
基因集合富集分析(GSEA)结果显示,感染的肺类器官多条信号通路上调,如TNF信号通路、IL-17信号通路、趋化因子信号通路等,其中IL-17信号通路的上调与COVID-19患者肺组织的检测结果相一致(图2f, h)。以上研究结果均表明人肺类器官模型可以作为研究SARS-CoV-2感染以及致病机制的工具。
 

图2f  hPSC诱导的肺类器官与对照组相比不同信号通路基因过表达分析

图2h  COVID-19患者与健康者相比不同信号通路基因过表达分析

Part 3
使用hPSC来源的肺类器官筛选治疗COVID-19的候选药物

 
为了明确能够阻断SARS-CoV-2伪病毒感染的候选药物,研究人员将hPSC来源的肺类器官转移至384孔板,培养6小时使其成团。选择FDA批准的药物以10 μM的浓度处理2小时后,将SARS-CoV-2伪病毒与肺类器官共培养,24小时后对类器官进行荧光素酶活性分析。选择Z值<-2孔使用的药物为候选药物。对不同浓度的候选药物进行药物效力和细胞毒性分析(图3e, f, g)。imatinib、mycophenolic acid(MPA)和quinacrine dihydrochloride(QNHC)三种药物被证实不依赖于细胞毒性,以剂量依赖的方式阻断SARS-CoV-2伪病毒感染。

图2e, f, g  Imatinib, MPA, QNHC效力及细胞毒性检测曲线


免疫荧光染色结果显示,使用10 μM imatinib、3μM MPA或4.5 μM QNHC处理肺类器官,可显著降低SARS-CoV-2伪病毒的感染率(图3h)。

图3h  SARS-CoV-2伪病毒感染imatinib, MPA, QNHC处理过的肺类器官


为了评估药物在体内的抗病毒感染活性,研究人员将LPs注射到NSG小鼠皮下,待其4个月生长成熟后,将imatinib、MPA和QNHC分别注射入异种移植体内,三小时后使用SARS-CoV-2伪病毒感染该移植体(图3i)。24小时的免疫荧光检测结果显示,三种药物均能阻止SARS-CoV-2伪病毒对AT2细胞的感染(图3j)。

图3i LPs诱导形成肺泡组织的小鼠体内给药方案
 

图3j  体内给药后,SARS-CoV-2伪病毒感染肺异种移植体


类器官因其在结构组织及功能上与体内组织器官高度相似,可用于体外模拟体内生理病理变化过程,因此选择人肺类器官做为COVID-19药物筛选的工具将会更加便捷。目前,已有三个使用imatinib治疗COVID-19患者的临床试验(NCT04346147, NCT04357613,NCT04356495)注册。使用类器官进行药物筛选的研究可以更好地为临床试验提供数据支持。