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PeproTech类器官答疑小课堂

发布时间:2020-06-01 10:48 |  点击次数:

 
类器官(organoids)是一种利用具有干性潜能的细胞体外培养出的3D细胞培养物。由于与对应的器官拥有高度相似的组织学特征,具有自我更新和自我组织能力,并能重现该器官的部分生理功能,因此类器官可作为多种疾病的体外模型,在干细胞与发育、再生医学、疾病研究、药物开发和精准医疗等多个方面拥有广泛的应用前景。类器官在体外培养时,由于周期较长,培养过程中注意事项较多,操作较为繁琐,在操作过程中难免会遇到些许"疑难杂症"导致实验失败!扎心且闹心~

那么PeproTech来帮您,让您在类器官培养的道路上,问题无需烦心~遇到就来问我们吧!

PeproTech已经开通了小肠/胃类器官培养指导服务,您可以预约指导时间。也可以随时拨打PeproTech技术热线:40000 53055 进行咨询

 

01 细胞准备篇

 

问:组织消化选择什么消化液,消化多长时间?

答:组织的消化液有两种,一种是EDTA,另一种是胶原酶,EDTA适合消化空腔性器官,例如小肠和胃;胶原酶消化比较广泛,一般会搭配DNA酶一起使用,基本适合所有组织的消化。不同组织消化时间差异比较大,从十几分钟到数时小时都有。

问:消化的温度如何选择?

答:EDTA消化可以在冰上进行,胶原酶的消化需要37℃,这样酶的活性最高。

问:基质胶培养之前,如何筛出干性细胞?

答:如果是单细胞,并且已知干细胞的特异性标记,可以通过流式分选或者磁珠分选。

问:类器官的培养必须要细胞具有干性吗?正常组织成熟体细胞可以做类器官培养吗?

答:只有干细胞扩增来源的培养物才能称之为类器官,因此干性是必要条件。正常组织的成熟体细胞中往往会有一部分成体干细胞(标志物为Lgr5,CD133等),这部分细胞可以进行类器官培养。

问:如何选择构建类器官的来源细胞?

答:理论上所有类器官都可以选择从ESC/IPSC来构建,部分类器官可以选择从组织中分离成体干细胞来构建,成体干细胞来源的类器官其构建周期短,体外传代次数多,相对而言构建成本低;根据实验需求,如果要通过类器官模型来研究器官的发育,需要对起始细胞进行基因编辑,一般都是通过ESC/IPSC来构建类器官。

 

02 类器官培养篇

 

问:类器官培养需要多长时间?

答:如果选择从ESC/IPSC来构建类器官,需要1-2月(甚至更长)才能构建成功,如果是选择从成体干细胞来构建类器官,一般只需要1-2周就可构建成功。

问:基质胶如何重悬细胞?

答:用基质胶去混细胞时,可以直接用基质胶去重悬细胞;也可以用培养基:基质胶=1:1的比例稀释后重悬细胞,但是不推荐更大比例稀释基质胶,因为加入过多的培养基时,胶滴容易散开,整个重悬过程在冰上操作,重悬细胞时禁止产生气泡。

问:不同孔板培养类器官培养所需的基质胶和培养基体积?

答:类器官常用24孔板进行培养,一般每孔种一个50μl的胶滴,加入500μl培养基覆盖胶滴;6孔板每孔可以种多个50μl的胶滴,加入2ml培养基覆盖胶滴;96孔板一般每孔种一个10μl的胶滴,加入200μl培养基覆盖胶滴。

问:基质胶可否反复冻融?

答:基质胶不建议反复冻融,偶尔冻融一两次没问题,多次冻融会影响基质胶内蛋白活性,但是要注意,基质胶凝固后不建议再用了。

 

03 类器官传代篇

 

问:类器官传代时如何收获类器官?如何将类器官分散开?

答:基质胶在4℃时会变得很软,吹打后可将基质胶分散开。通过离心去除上清液里的基质胶,收集的类器官重悬后可通过机械力吹打进行解离;也可以选择用Cell recovery solution来消化基质胶,使基质胶溶解,通过离心去除上清液里的基质胶,Cell recovery solution对细胞团消化作用不明显,因此更多时候类器官传代需要使用消化酶(包括胰酶)消化成单细胞或小细胞团。

问:类器官传代一般怎么传啊?

答:先把基质胶消化掉,可以对类器官消化(消化酶处理)或不消化(机械力吹打)。传代通常按照1:2、1:3、1:4甚至1:10的比例都有传代成功的例子。

问:如果传代,有没有对前一代类器官数量的要求?

答:由于传代过程中类器官会有损失,因此类器官传代时对前一代理论上有一定的数量要求,如类器官数量较少、尺寸较小、活性较差等都会影响传代培养效果。类器官传代须在类器官数量较多,且细胞状态较好时进行。传代时酶解或吹打尽量轻柔以免损伤细胞。并且传代操作时尽量避免反复操作以免造成较大的细胞损失。

04 肿瘤类器官篇

 

​问:肿瘤类器官的培养是否也会生成正常的类器官,是否会影响药敏测试的结果?

答:肿瘤类器官来源即为肿瘤组织,即使存在部分正常细胞,也是肿瘤微环境的一部分,且正常细胞的干性、增殖能力弱于肿瘤细胞,因此类器官建立后其大部分细胞为肿瘤细胞,少数正常细胞基本不会影响药敏测试。

问:培养肿瘤类器官需要原始肿瘤组织的大小是多少?活检样本量足够吗?

答:肿瘤类器官培养所需手术组织大概需要3颗黄豆大小以上,穿刺活检样本需要至少3针,内镜活检至少钳取6颗以上。因肿瘤异质性较大,建议可以取肿瘤组织不同部位分别进行类器官培养。

问:肿瘤类器官培养后能否建系?

答:部分肿瘤类器官是具有长期培养和稳定传代的能力的,这类类器官可用于建系,但不是所有类器官都可以建系。

05 类器官鉴定篇

 

问:如何去鉴定培养的类器官是否成功?

答:看类器官大小、结构以及是否具有特殊形态。一般初次培养,最好进行HE、免疫荧光、基因测序鉴定。