随着流式细胞仪的普及，流式细胞术的应用越来越广泛，特别是免疫学和干细胞生物学研究领域对流式细胞术的需求正在逐渐增多，然而，大家对流式细胞术的掌握程度参差不齐，大部分科研工作者对流式的应用还局限于四色以内分析，对于多色（6 色以上）分析往往会掌握不好，究其原因是染料搭配不合适，导致个染料之间干扰很大，结果没法分析。本文总结了流式多色染色的荧光搭配的六点原则，希望对广大科研工作者有一定的参考作用。
 

一. 选择流式细胞仪能检测的染料
 

流式细胞染色当确定好指标之后，需要给每个指标对应的抗体配上相应的荧光染料，我们首先要选择流式细胞仪能检测的染料，这就需要我们了解流式细胞仪以下信息：

（1）仪器有几个激发器（激光管）
 

下表列出了流式细胞仪的激发器和每个激发器对应能检测的染料 

                

上表仅列出了可能激发的染料，并未列出所有染料，但不是仪器配置了某个激发器就一定能激发出对应的染料，还需要根据仪器的通道配置来选择，每个激发器对应有哪些检测通道，每个检测通道只能对应检测一种染料，但不同染料可能是由同一个检测通道来检测，那么这些染料我们称之为荧光对等染料，荧光对等染料是不能共用的。

（2）每个激发器对应有哪些检测通道
 

下表列出了每个通道的荧光对等染料：

               
 

二. 弱表达抗原选择强荧光染料，强表达抗原选择弱荧光染料
 

荧光染料亮度有强弱之分，抗原表达够高低区别，因此，对于一些低表达的抗原，我们在搭配对应抗体的染料时，应该选择荧光较亮的染料，而对于高表达的抗原，我们则可选择相对较暗的荧光染料。

因抗原表达密度受细胞类型以及细胞活化程度的影响，所以在此无法详细列出各抗原的表达密度强弱。但荧光染料的强弱是固定的，下表列出了常见荧光染料的强度对比图。

                        

 

 

三. 弱低表达抗原应该选择染料之间有较小干扰的染料（即将弱表达抗原放在被干扰较小的检测通道），强表达抗原应该选择染料之间对其他染料干扰较小的染料（即将强表达抗原放在对其他通道干扰较小的检测通道）
 

低表达的抗原最终染色的信号较弱，容易受其他检测通道的干扰，因此为了其他通道的信号对其造成的干扰，我们应当选择干扰较小的检测通道，比如 FITC\ PE\ PE-Cy7\ APC 这四色一起检测时，若表达抗原应该选 APC 颜色的抗体；强表达的抗原最终染色的信号较强，容易对其他检测通道造成干扰，因此我们应该选择对其他通道干扰较小的荧光染料，举例如上。
                                      

四. 表达互相排斥的抗原可以放在相互干扰较大的检测通道，共表达的抗原避免放在相互干扰的通道
 

表达相互排斥的抗原指的是两种抗原不会同时表达在一种细胞上，这两种抗原表达在两种细胞上（例如CD4 和 CD8），因此流式图上分群很明显，即使荧光染料之间干扰很大，也很容易通过补偿的调节避免干扰，；而共表达的抗原指的是这两种抗原表达在同一种细胞上（例如 CD4 和 CD25），在流式图上我们是要分析双阳性的细胞比例，如果这两个抗体对应的荧光染料之间有干扰，则对圈门结果造成干扰，影响分析的细胞比例。

 

五：细胞内抗原检测优先选择小分子荧光素
 

胞内抗原的检测需要打孔，让标记荧光素的抗体分子可以进入细胞内，因此有两点要求：
第一：打孔试剂对荧光素没有影响。这就要求我们尽量不要选择复合染料（固定剂会使复合染料解偶联）。
第二：确保标记荧光素的抗体可以进入细胞内，这就要求荧光素标记的抗体分子量尽量小，所以我们优先选择小分子应该素，例如PE\ FITC\ APC。

      

六：上级抗原检测通道避免对下级抗原检测通道造成干扰
 

以上所述六点原则是多色配色中需要注意的要点，当然涉及多色配色（6 色以上）往往很难同时达到上述六点原则，我们只能尽可能满足这些要求，减少因荧光染料搭配不当对实验结果的影响。


美国 PeproTech （派普泰克）公司成立于 1998 年，总部位于美国新泽西洲。 PeproTech 公司是世界上最大的重组细胞因子和蛋白生产商之一，共生产 500 多种重组人、小鼠、大鼠细胞因子和蛋白，因其较高的性价比而受全球各实验室的青睐。
 

PeproTech Inc. 的产品涵盖免疫调节蛋白、白介素、集落刺激因子、生长因子、化学趋化因子、干扰素、脂联素、成纤维生长因子、转化生长因子、肿瘤坏死因子、神经营养素和防御素等诸多生命科学研究领域中重要的生物活性分子。2014 年 PeproTech 推出流式品牌 BioGems， BioGems 目前已有一千多种流式产品，涵盖多种荧光标记的流式抗体、具有生物活性的功能性抗体，以及流式细胞术辅助试剂，如溶血剂和破膜剂等，并不断有新产品发布。
 

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